iMuSCs, #９（１）

投稿日: 2016 年 7 月 23 日 作成者: kawamura
Methods, part１
Animal studies
The animal experiments and all experimental protocols were approved by the Center for Laboratory Animal Medicine and Care at The University of Texas Health Science Center at Houston (protocol No: AWC-13-134). All methods were carried out in accordance with the approved relevant guidelines and regulations. Mouse strains utilized in this study: C57BL/6J, BALB/c, SCID-beige, and mdx/SCID were purchased from the Jackson Laboratory, USA.

Cell isolation and maintenance
Mouse iMuSCs were isolated from the injured TA muscles of C57BL/6J (3–8-week-old female; Jackson Lab, USA) mice four days after laceration injury, while control MuSCs were isolated from uninjured TA muscles. The iMuSCs were separately cultured in ESGRO Complete PLUS Clonal Grade Medium (Millipore, USA) on 12-well tissue culture plates (Corning, USA) for 3 weeks. The medium was then replaced with normal muscle growth medium [Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with 20% Fetal Bovine Serum (FBS), 10% Horse Serum (HS), 1% chicken embryo extract (CEE; Accurate Chemical Co., UK), and 1% Penicillin-Streptomycin antibiotics; unless otherwise mentioned, all from Gibco, USA] and iMuSCs were further cultured and expanded on collagen type IV-coated flasks at 5% CO2 at 37 °C. C2C12 primary mouse myoblasts (purchased from ATTC, USA) and MuSCs were used as controls and were cultured on collagen type IV-coated flasks in growth medium in 5% CO2 at 37 °C. Characterization of iMuSCs was performed by applying standard in vitro and in vivo assays.
Generation and analysis of chimeric mice
Undifferentiated single cells of β-gal- and GFP-pre-labelled iMuSCs were transferred into blastocysts of BALB/c mice (Jackson Lab, USA) by microinjection following standard procedures8. Pregnant mice were sacrificed and E14 embryos were collected and dehydrated in a serial dilution of 30, 20 and 10% sucrose and then fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma, USA) and embedded in paraffin. Sections were stained with anti-GFP antibody, counterstained with eosin and visualized by fluorescent microscopy (Nikon).
Teratoma formation assay
IMuSCs were suspended at 1 − 2 × 106 cells/ml in Phosphate Buffered Saline (PBS). SCID-beige mice (Jackson Lab, USA) were anesthetized with diethyl ether and injected with 500 μl of the cell suspension subcutaneously into the dorsal flank. Seven weeks after the cell injection, tumours were surgically dissected from the mice. Samples were weighed, fixed in 4% formaldehyde, and embedded in paraffin. Sections were stained with hematoxylin and eosin.
 実験方法（１）
動物実験
動物実験とすべての実験手順は、ヒューストン・テキサス大学テキサス健康科学センター内動物医学ケアセンター研究所（the Center for Laboratory Animal Medicine and Care at The University of Texas Health Science Center at Houston）のプロトコール第AWC-13-134に従って了承された。すべての方法は、承認済ガイドラインと規則に準じて施行された。当該研究において使用されたマウスは次の通り：C57BL/6J、BALB/c、SCID-beige、およびmdx/SCIDの４種で、アメリカ、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory, USA）より購入した。
細胞の単離と培養
iMuSCsは、C57BL/6Jマウス（３～８週齢の雌をJackson Lab, USAより購入）を用いて、傷害後４日目のTA筋から単離した。一方、対照MuSCsは、非傷害TA筋から単離した。iMuSCsは、培養液ESGRO Complete PLUS Clonal Grade Medium (Millipore, USA)、及び１２穴培養プレート（Corning, USA）を用いて、３週間培養を継続した。その後培養液を正常筋成長培地[10%馬血清（HS）1%鶏胎抽出液（CEE、Accurate Chemical Co., UK）1%ペニシリン-ストレプトマイシンをそれぞれ添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)、特に言及がなければ、すべてGibco, USAより購入]で置換した。そして、iMuSCsはさらに培養を続け、5% CO2、 37 °Cの下で、４型コラーゲンをコーティングした培養フラスコで継代した。C2C12初代マウス筋芽細胞（ATTC, USAより購入）とMuSCsはコントロールとして使用し、コラーゲン４型をコーティングフラスコを用い、5% CO2、37 °Cの条件で培養した。iMuSCsの性質は、標準的in vitro及びin vivo実験を行ない検討した。
キメラマウスの発生と分析
β-galとGFPで予めラベルした未分化単細胞iMuSCsを、標準的なマイクロインジェクション法により、BALB/cマウス（Jackson Lab, USA）由来胚盤胞へと移入した。妊娠マウスを犠牲にし、E14胎児を取り出した。得られた胎児は、30、20、10%ショ糖希釈液にて脱水し、4%パラホルムアルデヒド（Sigma, USA）にて固定後パラフィン包埋した。切片は抗GFP抗体で染色、エオジンを用いて対比染色し、蛍光顕微鏡（Nikon）で可視化した。
奇形腫作成実験
リン酸バッファー生食（PBS）を用い、１-2×10の6乗個/mlのiMuSCs細胞の浮遊液を作成した。ジエチルエーテルを使って、SCID-beigeマウス（Jackson Lab, USA）を麻酔し、500 μlの細胞浮遊液を背側面の皮下に注射した。細胞浮遊液を注射してから７週間後、マウスから腫瘍を外科的に摘出した。得られたサンプルの重量を測定、4%ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。切片はへマトキシリン・エオジン染色した。

 

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