| Methods, part3 |
| Karyotype analysis Karyotypes were determined using conventional G-Banding analysis at the Texas Children’s Hospital Cytogenetic Core Lab, Houston, TX, USA. |
| Population doubling assay and histochemical staining for alkaline phosphatase To estimate the growth of cultures, a standard protocol was followed for population doubling assays. Briefly, 5000 iMuSCs were plated on collagen type IV-coated 6-well plates in growth medium for four days, and every day the well content was collected and counted. The approximate population doubling time (PDT) was determined as: , where, t = time period (24 h), N0 = initial cell number, Nt = number of cells at the time period. |
| Histological staining for alkaline phosphatase activity was carried out using a commercially available kit (Sigma-Aldrich, USA) following the manufacturer’s instructions. |
| Quantitative real-time PCR Total RNA was isolated using the RNeasy Plus Mini Kit (Quiagen, USA), and cDNA was synthesized from 1 μg of RNA via a High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies, USA) following the manufacturer’s instructions. Gene expression was analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR) using MyiQ real time PCR System (Bio-Rad, USA). The applied primers (Supplementary Table 3) were designed by Oligo software (Oligo Perfect Designer, Invitrogen, USA). Reactions were measured in duplicates using custom 2× Syber Green Master Mix based on the hot-start Jumpstart Taq DNA Polymerase enzyme (Sigma, USA). The amplification was done for 40 cycles (95 °C 20 sec, 60 °C 20 sec, 72 °C 40 sec). To verify the PCR products, melting curves and negative controls were carried out in each reaction. Relative quantification of mRNA was determined by the ΔΔCt method (2−ΔΔCt formula)19 by using the expression profile of the corresponding control samples as reference. |
| Data processing and statistical analysis Prism 6.0 (GraphPad Software, USA) was used for data plotting, non-linear regression and statistical analysis. Data are given as mean ± S.E.M. Comparisons between two groups were performed by using Student’s t-test assuming two-tailed distribution, and unequal variances. For multiple comparisons, ANOVA or Kruskal-Wallis test was applied. Statistical significance was considered at p < 0.05. |
| 実験方法（３） |
| 核型分析 核型は、テキサス子ども病院細胞遺伝学コア研究所（ヒューストン、TX、USA）の標準的Ｇバンディング解析を使って決定した。 |
| 細胞数倍加アッセイとアルカリフォスファターゼの組織化学的染色法 培養細胞の成長度合いを検討するために、標準的プロトコールにより、細胞数倍加アッセイを行なった。簡単に、5000個のiMuSCsを、4型コラーゲンコーティング６穴プレートに撒き、成長培養液を用い4日間培養し、細胞を毎日回収して細胞数を算出した。倍加時間の算出法は次の通り：Nt/N0=2(t/PDT)、t=時間間隔（24時間）、NO=その時間間隔における細胞数。アルカリフォスファターゼの組織染色は売られているキット (Sigma-Aldrich, USA)を使用して、添付文書に従い行なった。 |
| 量的リアルタイムPCR 全RNAはRNeasy Plus Mini Kit (Quiagen, USA)より分離、またcDNAはHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies, USA)を用い、添付文書に従って、1μgのRNAから合成した。遺伝子発現は、MyiQ real time PCR System (Bio-Rad, USA)を使い、量的リアルタイムPCRによって分析した。使用したプライマー（補足テーブル３）は、Oligo software社 (Oligo Perfect Designer, Invitrogen, USA)により作成して頂いた。反応は、hot-start Jumpstart Taq DNAポリメラーゼ(Sigma, USA)に基づいて、custom 2× Syber Green Master Mixを使って測定した。増幅は40サイクル（95℃で20秒、72℃で40秒）行なった。PCR産物量を確認するため、融解曲線とコントロールをそれぞれの反応において行なった。mRNAの相対量は、参考文献にあるように対応対照サンプルの発現状況を使って、ΔΔCt法(2−ΔΔCt formula)19によって判定した。 |
| データ処理と統計学的解析 データの描出、非直線回帰、統計学的解析は、Prism 6.0 (GraphPad Software, USA)解析ソフトを用いて行なった。データは平均±S.E.M.にて算出した。２グループ間の比較は、両側分布を仮定しStudentのt-検定及び不等分散で行なった。多重比較に関しては、ANOVAまたはKruskal-Wallis検定を適応し施行した。統計学的有意差は、p < 0.05において有意とした。 |