ドクターKのぶらり独り言

Collectively, our findings demonstrate that iMuSCs represent a unique, very sensitive population of cells that possess characteristics (morphology, size, and a gene expression profiles) that differs from all cell types studied so far. IMuSCs not only display several characteristics typical of ESCs (e.g. a large nucleus surrounded by a narrow rim of cytoplasm, high nuclear/cytoplasmic ratio, open chromatin, unstructured nucleoplasm, and diploid number of chromosomes) (Table 1), but also express several pluripotency marker genes while maintaining a high expression level of myogenic genes. Moreover, the most remarkable discovery of this study was that iMuSCs fulfilled several in vitro and in vivo criteria for pluripotency; however, we could not obtain iMuSCs with germline transmission after blastocyst microinjection. This may be due to the fact that iMuSCs have a lower gene expression profile of the pluripotency markers (e.g., Oct4, Nanog,and Sox2) and lack Esg1 and Dax1 expression when compared to ESCs. It is also plausible that the relatively high expression of Blimp1, Fragilisand myogenic marker genes by the iMuSCs may contribute to this observation. These results indicate that iMuSCs do not regress completely to pluripotency and possibly hold an epigenetic memory of their myogenic tissue origin. Further manipulation of the iMuSCs, such as the inhibition of DNA methylases or Nanog overexpression, could potentially push the iMuSCs to achieve full pluripotency.

Thus, the key conclusion from our study is that changes in microenvironmental factors, such as skeletal muscle with injuries, can partially reprogram terminally differentiated myogenic cells into a pluripotent-like state.

すなわち、我々の研究によって、iMuSCsは、これまで報告された細胞のタイプとは異なる、大変ユニークかつ特徴的な細胞集団（形態学、細胞のサイズ、遺伝子発現状況の点から）であることが示された。また、iMuSCsはＥＳ細胞に特有な特徴をいくつか有するだけでなく（例えば、狭小細胞質に囲まれた大きな核、高い核細胞質比、解放染色質、無構造の核質、倍加染色体数）（テーブル1）、高い筋源性遺伝子発現を維持しつつ、多能性マーカー遺伝子をも発現していることが分かった。さらに、我々の研究の中で最も重要な発見は、iMuSCsが、in vitro、 in vivoいずれにおいても、多能性であるための条件を満たしているという点である。しかしながら、胚盤胞マイクロインジェクション後、生殖細胞移入iMuSCsを得ることができなかった。この理由は、恐らくiMuSCsが多能性マーカーの遺伝子発現率が低いこと（例えば、Oct4、Nanog、Sox2）や、ＥＳ細胞と比較すると、Esg1やDax1が発現されていないことが関与しているのではないかと思われる。また、iMuSCsにおけるBlimp1、Fragilis及び筋源性マーカー遺伝子の高い発現率も影響しているのかもしれない。以上の結果は、iMuSCsは多能性へと完全に後退した細胞集団ではなく、筋源性組織由来のエピゲネティック記憶をも有していることを示す。ＤＮＡメチラーゼの抑制、或いはNanogの過剰発現といったiMuSCsの細胞内操作が、完全多能性を有するiMuSCsを作成するために有用な手段である可能性がある。

当研究において最も重要な結論は以下の通りである。傷害性骨格筋のような微細環境の変化が、最終分化した筋源性細胞を多能性様状態へと部分的に再プログラムさせ得るということ。

To evaluate whether the iMuSCs could give rise to chimeric mice, a blastocyst injection assay was performed (Fig. 4c). We transferred undifferentiated β-gal+ and GFP-pre-labelled iMuSCs as single cells into BALB/c (Jackson Lab, USA) blastocysts by microinjection following standard procedures8. We obtained eight embryos at E14, six of which developed properly and demonstrated the contribution of GFP+ iMuSCs to the embryo. A high-to-moderate contribution of β-gal and GFP-expressing cells could be seen in these E14 chimeric embryos (Fig. 4c,d and Supplementary Fig. S4a). Histological analysis confirmed that the iMuSCs contributed to all three germ layers (Fig. 4e and Supplementary Fig. S4b). Offspring derived from the iMuSCs-injected blastocysts were born and developed normally. After repeating this experiment 3 times, we obtained 23 pups, all born with a white coat (Supplementary Table S1). Although their hair did not display iMuSCs germline transmission, immunostaining and qPCR analysis revealed the presence of LacZ+ and GFP+ iMuSCs in several tissues of the pups, such as skin, muscle, heart, lung, kidneys, spleen, and brain (Fig. 4f and Supplementary Fig. S4c).

iMuSCsがキメラマウスになりうるのかどうかを評価するために、次に我々は、胚盤胞注入試験を行なった（図4c）。一般的なマイクロインジェクション手技に従い、 BALB/c（Jackson Lab, USAより購入）の胚盤胞の中に単一細胞として、未分化β-gal陽性のiMuSCsとGFP標識iMuSCsを移注した。E14個体中８体の胎児を得た。８個体のうち６体は正常に発育し、その胎児にGFP陽性iMuSCsの分布を確認できた。β-gal及びGFP-陽性細胞の発現頻度は、高頻度ないし中等度であった（図4c及びd、補足図S4a）。組織学的検討により、iMuSCsは３胚葉すべてに分布していることが分かった（図4e及び図S4b）。iMuSCsを注入して作成した胚盤胞から誘導されたマウスが生まれ、正常に発育した。３回同様の実験を行ない、我々は２３匹の子マウスを得、すべて白い体毛に覆われていた（補足テーブルS1）。子マウスの体毛は iMuSCsの生殖細胞系の移入を示さなかったが、免疫染色及び定量リアルタイムPCR（qPCR）による解析から、LacZ陽性及びGFP陽性のiMuSCsは、子マウスの皮膚、筋、心臓、肺、腎臓、脾臓そして脳といったいくつかの組織において存在していることが明らかとなった（図S4c）。

To clarify the pluripotent potential of the iMuSCs, we performed differentiation assays6,7 in vitro that showed that the iMuSCs were able to form embryoid bodies (EBs) in a petri dish (Fig. 3d,e). After seven days in suspension culture, EBs were expanded and initiated spontaneous differentiation into a variety of ectodermal and mesodermal germ layer derivatives, and after an additional two weeks in culture, attached EBs formed contracting multinucleated myotubes encompassed with neural-like structures (Fig. 3f,g).

iMuSCsの多能性を検証するために、我々は、in vitro分化誘導試験を行なった。その結果、iMuSCsは、培養皿の中で胚様体を形成することが分かった（図3d及びe）。浮遊培地で培養後７日目、胚様体（EBs）は拡大し、さまざまな外胚葉や中胚葉誘導体へと自発的に分化を開始した。さらに培養２週間後、付着した胚様体（EBs）は、神経様構造体によって囲まれた、収縮する多核筋管を形成した（図3f及びg）。

結果（その１）

＊オプジーボ（→こちらを参照）

読売新聞 4月26日(火)7時53分配信理化学研究所や京都大などの研究グループは、アトピー性皮膚炎の原因となる遺伝子を、マウスを使った実験で突き止めたと発表した。　新たな治療薬や予防法の開発などにつながる成果という。米医学誌「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション」電子版に２６日、掲載される。理研の吉田尚弘研究員らは、アトピー性皮膚炎を発症するマウスを調べ、「ＪＡＫ１」というたんぱく質の遺伝子の一部が変化し、異常に活性化しているのを発見。その結果、皮膚の角質に働く酵素も活性化し、角質がはがれて刺激を受けやすくなっていることが分かった。ＪＡＫ１の働きを防ぐ塗り薬や、刺激から皮膚を守るワセリンなどをマウスに塗ると、アトピー性皮膚炎の発症を予防できた。

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この記事の元となった論文がこれだ。

Hyperactivation of JAK1 tyrosine kinase induces stepwise, progressive pruritic dermatitis

Abstract
Skin homeostasis is maintained by the continuous proliferation and differentiation of epidermal cells. The skin forms a strong but flexible barrier against microorganisms as well as physical and chemical insults; however, the physiological mechanisms that maintain this barrier are not fully understood. Here, we have described a mutant mouse that spontaneously develops pruritic dermatitis as the result of an initial defect in skin homeostasis that is followed by induction of a Th2-biased immune response. These mice harbor a mutation that results in a single aa substitution in the JAK1 tyrosine kinase that results in hyperactivation, thereby leading to skin serine protease overexpression and disruption of skin barrier function. Accordingly, treatment with an ointment to maintain normal skin barrier function protected mutant mice from dermatitis onset. Pharmacological inhibition of JAK1 also delayed disease onset. Together, these findings indicate that JAK1-mediated signaling cascades in skin regulate the expression of proteases associated with the maintenance of skin barrier function and demonstrate that perturbation of these pathways can lead to the development of spontaneous pruritic dermatitis.

以下、abstractのみ見てみよう。

抄録
皮膚の代謝は、表皮細胞の絶え間ない増殖と分化によって維持されている。皮膚は病原微生物や外力、あるいは化学物質に対して強固かつ柔軟性に富んだバリアを形成している。しかしながら、このバリアを維持している生理学的メカニズムは十分理解されていない。我々は次のような大変貴重なミュータントマウスを作成し、実験に用いた。このマウスは成長とともに自発的に掻痒症を発症する。その理由は、Ｔｈ２（ヘルパーＴ２）偏行性免疫反応の誘導により皮膚代謝の初期反応が欠如しているためだ。さらに、ＪＡＫ１チロシンキナーゼにおける単一アミノ酸の置換によりこの酵素が過剰に活性化されるという突然変異を有している。その結果、皮膚のセリンプロテアーゼが過剰に発現し、皮膚のバリア機能が破壊される。正常皮膚バリア機能を維持する軟膏塗布によって、ミュータントマウスの掻痒症発症を遅延させることに成功した。ＪＡＫ１の阻害剤もまた掻痒症の発症を遅らせることができた。以上から、ＪＡＫ１を介するシグナル伝達系は、皮膚バリア機能を維持に関与するプロテアーセの発現を制御していることが明らかとなった。また、これらの伝達系への介入は持続的な掻痒症の進展に至ることが証明された。

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話は変わるが、小生がクローニング（単離）したＪＡＫ３というチロシンキナーゼは、このＪＡＫ１とともにJanus kinase familyのメンバーだ。当時明らかとなったストーリーがうまく表現された漫画を見つけたのでクリップしておこう。

これだ。

アルツハイマー病のマウスを使った実験で、思い出せなくなった記憶を引き出すことに成功したとの研究成果を、理化学研究所の利根川進・脳科学総合研究センター長らが、英科学誌ネイチャーで１７日発表する。

研究チームは「アルツハイマー病は、記憶が消えるのではなく、記憶を思い出す機能が働かなくなる病気であることを示唆する結果だ」と説明している。

研究チームは正常なマウスとアルツハイマー病のマウスを飼育箱に入れ、それぞれ脚に弱い電流を流して、不快な体験として記憶させた。その後、箱から出し、２４時間後、箱に戻した。

正常なマウスは不快な体験を思い出しておびえたが、アルツハイマー病のマウスは変化を見せなかった。そこで、脚に電流が流れた時の記憶を担っているとみられた脳細胞を刺激すると、正常なマウスと同じようにおびえるようになった。

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この記事の元になったのが、Nature誌に掲載されている論文だ。ＡＤ（アルツハイマー病）に関する彼の論文はいくつかあるが、この記事が紹介しているのは、最新の論文（以下）と思われる。上の記事に「英科学誌ネイチャーで１７日発表予定」とあるので、Published online 16 March 2016と記されているこの論文がそれのようだ。

以下、Nature誌からサマリーのみだが引用して見ておきたい。利根川教授がlast authorとなっているので、彼の指導の下でなされた研究ということになる。主に手を動かしたのがfirst authorであるDheeraj S. Royという名の研究員だ。

Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer’s disease

Dheeraj S. Roy,
Autumn Arons,
Teryn I. Mitchell,
Michele Pignatelli,
Tomás J. Ryan
& Susumu Tonegawa

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive memory decline and subsequent loss of broader cognitive functions1. Memory decline in the early stages of AD is mostly limited to episodic memory, for which the hippocampus has a crucial role2. However, it has been uncertain whether the observed amnesia in the early stages of AD is due to disrupted encoding and consolidation of episodic information, or an impairment in the retrieval of stored memory information. Here we show that in transgenic mouse models of early AD, direct optogenetic activation of hippocampal memory engram cells results in memory retrieval despite the fact that these mice are amnesic in long-term memory tests when natural recall cues are used, revealing a retrieval, rather than a storage impairment. Before amyloid plaque deposition, the amnesia in these mice is age-dependent3, 4, 5, which correlates with a progressive reduction in spine density of hippocampal dentate gyrus engram cells. We show that optogenetic induction of long-term potentiation at perforant path synapses of dentate gyrus engram cells restores both spine density and long-term memory. We also demonstrate that an ablation of dentate gyrus engram cells containing restored spine density prevents the rescue of long-term memory. Thus, selective rescue of spine density in engram cells may lead to an effective strategy for treating memory loss in the early stages of AD.

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アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経退行性疾患のひとつであり、進行性の記憶力減弱と引き続く広汎な認知機能の欠損を特徴とする。ＡＤ発症初期における記憶力の減弱は、エピソード記憶に限られているが、その理由として海馬が重要な役割を担っている。しかしながら、ＡＤ初期において観察される記憶喪失が、エピソード情報の暗号化と統合の破壊によるのか、蓄積された記憶情報の取り出しの障害なのか、いまだ明らかではない。ここに我々は、初期ＡＤを有するトランスジェニックマウスにおいて、海馬の記憶痕跡細胞を光遺伝学的方法により活性化すると記憶の回復が起こることを見い出した。使用したトランスジェニックマウスは、長期間に渡る記憶テストにおいて記憶力喪失が証明されている。自然記憶回復法を用いて検討すると、記憶情報の蓄積障害ではなく、蓄積された記憶情報の取り出しの障害であることが分かった。アミロイド斑が沈着する前では、これらのマウスにおける記憶喪失は、年齢依存的であり、海馬の歯状回記憶痕跡細胞の脊髄緻密性の進行性減少と相関性がある。歯状回記憶痕跡細胞の貫通線維シナプスにおける光遺伝学的誘導の長時間刺激は、脊髄緻密性と長期記憶の両者を回復した。加えて、緻密性を回復した脊髄を含む歯状回記憶痕跡細胞の切除は、長期記憶の再生を阻害した。かくして、記憶痕跡細胞における脊髄緻密性の選択的再生は、アルツハイマー病初期における記憶障害を治療する上で有用な手段となる可能性がある。

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要するに、記憶の保管には問題はないが、記憶の取り出しができないのがＡＤの病態であるということだ。ある人の顔は覚えているが、名前が思い出せないといったことはよくあること。これって、まずいのかな。。。

京都大大学院の三嶋理晃教授（呼吸器内科学）らの研究グループは、ヒトｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）から、肺に異物や病原体などが進入することを防ぐ繊毛などになる５種類の「気道上皮細胞」を、効率的に作り出す方法を世界で初めて確立したと発表した。研究成果は米科学誌「ステムセル・リポーツ」電子版で２４日正午（米東部時間）に公開された。

気管を覆う気道上皮細胞は、粘液の分泌と繊毛の振動運動で異物を体外へ除去する機能を果たす。この細胞の遺伝子に異常のある原発性繊毛機能不全症（小児慢性特定疾患）や嚢胞（のうほう）性線維症（難病）などの患者は、この機能が不十分なため感染症などを繰り返す。

研究グループは、ｉＰＳ細胞を分化させる過程で、気道上皮細胞となる細胞だけを取り出し、実際の体内環境に近い三次元で培養。繊毛となる細胞や粘液を出す細胞など５種類の気道上皮細胞の分化に成功した。

これまで病態研究の際には、患者や健常者から気道上皮細胞を採取して利用していたが、大量採取ができないのが課題だった。細胞が大量に作り出せることで、病態解明や新薬の開発が進むほか、将来的にはｉＰＳ細胞から作った気道上皮細胞を利用し、肺臓器の再生にもつながる可能性があるという。

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この記事の中で意味不明な箇所がある。指摘しておく。

＞繊毛などになる５種類の「気道上皮細胞」

繊毛は繊毛細胞がその表面に有する構造体の一種なので、「繊毛となる細胞」という表現はおかしい。「繊毛を有する細胞」と書くべきだろうと思う。

これ以下の内容に特に問題はないようだが、以下に掲げる三嶋理晃教授の研究サマリーを読むと、５種類の「気道上皮細胞」ではなく、「繊毛上皮細胞、クラブ細胞、基底細胞、粘液産生細胞、神経内分泌細胞といったさまざまな気道上皮細胞の成分を含む嚢胞構造」が正しい表現であることが分かる。

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概要

肺の気管を覆う気道上皮細胞は粘液を分泌し繊毛の運動によって流れを作り出すこと
（粘液繊毛クリアランス）によって、異物や病原体を除去するのに重要な役割を果たしています。これまでヒトの細胞でこの研究を進めるためには患者さんやボランティアの方から同意を得て取得した気道上皮細胞が用いられてきましたが、気道繊毛上皮細胞を制限なく入手することは難しかったため、解決手段の一つとしてヒトiPS 細胞を気道上皮細胞に分化させる技術の開発が期待されてきました。
今回、三嶋理晃教授の研究グループの後藤慎平特定助教（京都大学医学部附属病院 呼吸器内科）、小西聡史大学院生（京都大学大学院医学研究科呼吸器内科学講座）らは、ヒトiPS 細胞を段階的に分化させ、表面蛋白質Carboxypeptidase M (CPM)を用いて肺の元となる細胞（腹側前方前腸細胞）を単離し、サイトカインや化合物などを加えながら様々な条件で三次元培養を試みました。その結果、昨年報告した肺胞上皮細胞の分化誘導法とは異なり、繊毛上皮細胞、クラブ細胞、基底細胞、粘液産生細胞、神経内分泌細胞といったさまざまな気道上皮細胞の成分を含む嚢胞構造を作る方法を開発しました。また、様々な発生のプロセスで分化に重要とされるNotch シグナルを抑制すると、気道繊毛上皮細胞や神経内分泌細胞が効率よく誘導されることが分かりました。さらにヒトiPS 細胞から作られた気道繊毛上皮細胞の機能を解析するため、分化誘導した繊毛上皮細胞をシート状に培養する方法を開発し、大阪大学大学院生命機能研究科／医学系研究科の月田早智子教授、立石和博大学院生との共同研究により、ヒトiPS 細胞から作られた気道繊毛上皮細胞が、体の中と同じように規則正しく振動し、粘液を動かす機能を持つことを示しました。呼吸器内科の診療ではCOPD、気管支喘息、気管支拡張症など、気道の粘液繊毛クリアランスの異常をもたらす疾患は非常に多く、一方で、嚢胞性線維症や原発性繊毛機能不全症など粘液繊毛クリアランスに直接関係する遺伝子の異常により、若年時から感染症を繰り返す重篤な疾患も見過ごせません。ヒトiPS 細胞から気道上皮細胞に分化させる技術が確立したことで、これらの病態解明や創薬の研究が大きく前進することが期待されます。

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さて、この記事の元となった論文がこれだ。

Directed Induction of Functional Multi-ciliated Cells in Proximal Airway Epithelial Spheroids from Human Pluripotent Stem Cells

略文字が多数登場するので、うっとうしさがあるが、慣れてくればさほど気にならない。

ポイントは、Highlightsにあるように、

・CPM（carboxypeptidase M（カルボキシペプタイドＭ、分化抗原マーカーと思われる）は、ヒト近位気道上皮の発生を研究する上で有用なマーカーである。
・３次元培養は、in vitroの系において、ヒト気道上皮細胞を誘導するには大変有用な手段である。
・DAPT( N-[N-(3, 5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)は、気道繊毛細胞（multi-ciliated cells)や肺神経内分泌細胞（pulmonary neuroendocrine cells)の誘導を促進する。
・誘導された気道繊毛細胞は機能的な可動性繊毛を有する。

•CPM is a useful marker for generating human proximal airway epithelium
•Three-dimensional culture is useful for inducing human airway epithelium in vitro
•DAPT promotes the induction of multi-ciliated and pulmonary neuroendocrine cells
•Induced multi-ciliated airway cells have functionally motile cilia

・・以下省略